Extraction d’ADN - Bertin Instruments

Extraction d’ADN

L’obtention d’ADN de haute qualité et en quantité suffisante à partir d’un échantillon biologique nécessite un processus d’homogénéisation robuste. Dans cette page, notre équipe de scientifiques partage des conseils utiles pour choisir le bon protocole d’homogénéisation pour votre extraction d’ADN

L’analyse d’ADN est un outil puissant pour comprendre les processus biologiques. La plupart des techniques d’analyse d’ADN commencent par l’extraction de l’ADN. Dans ce processus, l’ADN est libéré d’un échantillon et purifié. L’étape de libération consiste à casser les membranes cellulaires pour exposer l’ADN. Les tissus mous tels que le cerveau, le foie et le pancréas sont relativement faciles à homogénéiser.

Cependant, les tissus durs (p. ex. les tumeurs), les tissus élastiques (p. ex. l’intestin et la peau) et les échantillons environnementaux (p. ex. le sol) sont contraignants pour la préparation d’échantillons pour l’extraction de l’ADN. Ces types d’échantillons possèdent des propriétés mécaniques et structurelles qui rendent les procédures d’homogénéisation difficiles à standardiser. En outre, la plupart des matériaux biologiques complexes contiennent des inhibiteurs de PCR et des enzymes qui peuvent dégrader les acides nucléiques présents dans l’échantillon. Une homogénéisation complète doit être réalisée pour obtenir un rendement d’ADN élevé tout en conservant l’intégrité des acides nucléiques. Pour la plupart des applications, il est important de concevoir un protocole reproductible à haut débit pour l’étape d’homogénéisation.

La lyse mécanique, et plus particulièrement la technologie de bead-beating suivie (ou non) par une digestion par des proteases (protéinase K, lysozyme) a été largement reconnue comme la méthode de référence pour les protocoles d’homogénéisation des échantillons et d’extraction de l’ADN. Pour cette raison, Bertin Technologies a choisi la technologie bead-beating en 3D pour développer sa large gamme d’homogénéisateurs, les homogénéisateurs Precellys.

Ci-dessous, nos scientifiques ont partagé leurs conseils de bonnes pratiques pour l’homogénéisation par bead-beating afin de maximiser la qualité de l’ADN obtenu.

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Conseils pour une extraction d’ADN réussie

Les biologistes travaillent sur une variété d’échantillons allant des bactéries aux tissus animaux et aux tissus végétaux. Ces échantillons varient considérablement dans leurs structures physiques et leurs compositions. Il existe sur le marché une grande variété de kits de purification d’ADN conçus pour traiter ces différents types d’échantillons. Bien que ces kits varient, la plupart d’entre eux nécessitent une étape d’homogénéisation avant que l’ADN puisse être extrait. Nos homogénéisateurs Precellys sont compatibles avec une grande variété de kits, y compris ceux qui utilisent un tampon de lyse et des tubes de 2 ml remplis de billes.
Il a été démontré que l’homogénéisation par bead-beating améliore le rendement du processus d’extraction d’ADN, comme le montre la figure 1. Si votre kit ne fournit pas déjà de tubes de lyse par bead beating, consultez la liste ci-dessous pour trouver une référence adaptée à l’échantillon sur lequel vous travaillez.

Instruments needed for DNA extraction protocol

Figure 1 : comparaison des méthodologies de lyse enzymatique avec homogénéisation par bead-beating Precellys.

Concentration comparison of previous extraction method to Precellys / EZ extraction

A- Comparaison de la concentration d’ADN extrait de tissus fœtaux et néonatals avec la méthode Precellys et avec la méthode basée sur le traitement par incubation dans une solution de Proteinase K (du West Midlands Regional Genetics Laboratory, Royaume-Uni).

Comparison of DNA extracted from chlorella sorkiniana (algae) with Precellys method and with Proteinase K heating treatment based method (from Promega)

B- Comparaison de l’ADN extrait de la chlorella sorkiniana (algue) avec la méthode Precellys et la méthode basée sur le traitement par incubation dans une solution de Proteinase K (de Promega).

Une fois qu’un kit de lyse par bead-beating adéquat a été choisi, l’étape suivante consiste à choisir les meilleurs paramètres pour une homogénéisation efficace.

Lorsque vous travaillez avec de petites billes, il est important de bien choisir la vitesse et la durée du cycle d’homogénéisation ; ces paramètres affectent la taille des fragments d’ADN obtenus comme le montre la figure 2. Ceci est particulièrement important lors de l’homogénéisation des bactéries. La paroi bactérienne est difficile à homogénéiser et de petites billes de verre sont généralement requises pour obtenir une homogénéisation efficace. Nous conseillons de toujours commencer par des cycles d’homogénéisation inférieurs à 30 secondes et à vitesse modérée (soit 4 200 rpm pour Precellys 24 et 6 000 rpm pour Precellys Evolution).

Figure 2 :

A-bovine-liver

A- Foie de bovins

Electrophorèse sur gel d’agarose (1,5 %, 1xTAE) d’ADN isolé à partir de foie de bovins homogénéisé avec Precellys® Evolution à 4 600, 5 900, 7 200, 8 200, 8 800 rpm ; 1 x 20 s, avec kit CKMix (billes d’oxyde de zirconium de 2,8 mm et 1,4 mm) Cela montre que des valeurs de vitesse supérieures à 7 200 rpm conduisent à une dégradation visible de l’ADN dans le tissu hépatique bovin. Le rendement de 4 600 à 7 200 rpm était de 48 μg ; une énergie plus élevée a réduit le rendement à environ 28 μg d’ADN.

B-Arabidopsis-leaves

B- Feuilles d’Arabidopsis

Electrophorèse sur gel d’agarose (1,5 %, 1xTAE) d’ADN isolé à partir de feuilles d’Arabidopsis homogénéisées avec Precellys® Evolution à 4 600, 5 900, 7 200, 8 200, 8 800, 10 000 rpm ; 1 x 20 s, avec kit CKMix (billes d’oxyde de zirconium de 2,8 mm et 1,4 mm). Cela montre que le rendement et la qualité sont comparables dans la plage de 4 600 à 8 800 rpm, alors qu’une dégradation a été observée à 10 000 rpm (de PEQLAB, Erlangen, Allemagne).

L’homogénat obtenu contient parfois des contaminants tels que des protéines, des polysaccharides et des polyphénols. La digestion de l’échantillon avec de la Protéinase K (cellules, tissus animaux) ou du Lysozyme (bactéries) est une méthode efficace pour éliminer les protéines contaminantes. L’utilisation d’un tampon CTAB (contenant du bromure de cétrimonium) facilite la séparation des polysaccharides pour les échantillons végétaux.

Si vous avez d’autres questions, contactez nos ingénieurs d’application qui se feront un plaisir de vous recommander les meilleurs protocoles pour vos échantillons. Notre base de données complète de protocoles se trouve dans notre Application center.

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