Extraction d’ARN - Bertin Instruments

Extraction d’ARN

La purification d’ARN présente de nombreux défis, en particulier dans le cas d’échantillons complexes. Parmi les difficultés les plus couramment rencontrées, on trouve : un rendement trop faible, une faible pureté, une dégradation de l’ARN et une contamination par l’ADN. Bertin partage son expertise en présentant les protocoles d’homogénéisation permettant un isolement réussi d’ARN de haute qualité.

L’ARN est une molécule impliquée dans la régulation et l’expression des gènes. Depuis la découverte du rôle de l’ARN comme intermédiaire clé entre l’ADN et les protéines, l’extraction de l’ARN est devenue une activité cruciale en biologie moléculaire. Cependant, l’isolement de l’ARN à partir d’échantillons est largement considéré comme une tâche délicate. En raison de sa structure monobrin qui diffère des doubles brins de l’ADN, l’ARN est notoirement instable et sensible aux augmentations de température. Les RNases, un groupe d’enzymes qui dégradent les molécules d’ARN, se trouvent souvent en grande quantité dans l’environnement. Les défis courants de l’extraction d’ARN incluent une dégradation de l’ARN, un faible rendement, une faible pureté et une contamination de l’ADN. Par ailleurs, certains types d’échantillons ont des propriétés qui nécessitent des traitements spéciaux. Par exemple, les tissus animaux contiennent de l’RNase endogène qui doit être inactivée immédiatement après le prélèvement des échantillons pour empêcher la dégradation de l’ARN. Les échantillons végétaux et fécaux peuvent contenir des inhibiteurs (p. ex. des acides humiques et des polyphénols) qui peuvent coprécipiter avec l’ARN et affecter l’analyse en aval.

En tant que première étape de l’extraction de l’ARN, l’homogénéisation des échantillons joue un rôle crucial dans la maximisation du rendement et de la qualité de l’ARN extrait. L’homogénéisation complète de l’échantillon est essentielle pour que la procédure d’extraction se déroule sans problèmes. En effet, une homogénéisation incomplète suivie par des méthodes d’extraction basée sur l’utilisation de colonnes peut provoquer un bouchage des colonnes ainsi que d’autres problèmes. Chez Bertin Technologies, notre équipe de scientifiques a développé une gamme d’homogénéisateurs basés sur le bead-beating, les Precellys, pour simplifier les extractions d’ARN .

Ci-dessous, nos scientifiques partagent leurs conseils pour concevoir des protocoles d’homogénéisation optimisés afin d’obtenir des hauts rendements d’ARN et un ARN de haute qualité.

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Conseils pour réussir votre extraction d’ARN

Stabilisation de l’ARN dans l’échantillon

Dès que l’échantillon a été prélevé, l’ARN doit être protégé contre la dégradation causée par la chaleur ou les RNAses. Une méthode courante pour inactiver la RNAse est l’utilisation de tampons contenant des agents chaotropiques tels que l’isothiocyanate de guanidinium, le chlorure de guanidinium, le Sodium Dodécyl Sulfate (SDS) et l’urée. Le TRIzol ou le RNAlater peuvent être utilisés pour conserver l’intégrité de l’ARN. Les échantillons peuvent également être congelés dans de l’azote liquide pour éviter la dégradation de l’ARN.

Travailler dans un environnement sans RNAse

Il est essentiel de travailler dans un environnement sans RNase pour réaliser une extraction d’ARN réussie. Si possible, il est préférable de définir une zone de paillasse spécifique pour votre extraction d’ARN, qui doit être maintenue aussi propre que possible. Les zones de travail doivent être décontaminées avec une solution de décontamination de surface RNase avant de commencer toute extraction. Il est également important de choisir soigneusement les matériaux utilisés lors de toute tentative d’extraction de l’ARN. Les articles en plastique jetables Rnase-free sont fortement recommandés. Les kits de lyse Precellys sont à usage unique et certifiés sans DNAse/RNase. D’autres matières plastiques non jetables peuvent être traitées avec une solution EDTA 0,1 M NaOH 1 mM et rincées avec de l’eau Rnase-free.

Nous vous recommandons fortement de porter des gants stériles jetables et de les changer après tout contact avec du matériel ne faisant pas partie de votre zone de travail sans RNase. Nous vous recommandons également de porter un masque et des lunettes de protection pendant le travail. Enfin, il est important de s’assurer que tous les réactifs utilisés dans votre flux de travail doivent être sans RNase et utilisent de l’eau traitée au DEPC.

Contrôle de la température

La chaleur peut provoquer la dégradation de l’ARN. L’homogénéisation bead-beating peut générer de la chaleur mécanique. Pour cette raison, la température de l’échantillon pendant l’homogénéisation doit être contrôlée autant que possible. Pour relever ce défi, Bertin Technologies a développé le module Cryolys Evolution, un système de refroidissement automatisé qui permet aux chercheurs de contrôler la température de leur échantillon pendant tout le processus d’homogénéisation. Pour la plupart des protocoles d’extraction de l’ARN, nos scientifiques recommandent d’utiliser l’homogénéisateur Precellys Evolution avec le Cryolys Evolution réglé à 4°C pendant l’étape d’homogénéisation.

Choix du kit de lyse Precellys

La matrice de lyse adéquate doit être choisie pour garantir une homogénéisation complète de l’échantillon et maximiser la récupération d’ARN de haute qualité. Veuillez consulter notre liste de kits de lyse avec des recommandations pour différents types d’échantillons.

Si vous avez d’autres questions, n’hésitez pas à contacter nos ingénieurs d’application, ils se feront un plaisir de vous recommander un kit et un protocole de lyse adaptés.

Ratio échantillon de tissu/tampon d’extraction d’ARN

Un autre facteur clé pour une extraction d’ARN réussie est d’identifier la taille de l’échantillon que votre kit peut traiter. Lisez attentivement les instructions de votre kit d’extraction d’ARN et évitez de surcharger le tube d’extraction qui pourrait affecter le rendement et la qualité de l’ARN.

Exemple :
Solutions de thiocyanate de guanidinium : 100 mg d’échantillon de tissu, 5-10 x 106 cellules (animales/végétales) ou 1×107 bactéries pour 1 mL de tampon.

RNA extracted from whole mouse kidneys

Figure 1 : ARN extrait de reins entiers de souris. Programme Precellys Evolution et Cryolys Evolution : 6 500 rpm, 20 s x 2, pause : 10 s à 4°C, avec kit de lyse CK14 (billes céramiques de 1,4 mm). Après l’homogénéisation, l’homogénat a été transféré dans un nouveau tube de 2 ml et les billes ont été rincées avec 200 ul de Trizol. Les 1,2 ml résultants ont été soumis à une extraction au Trizol standard. L’intégrité de l’ARN a été vérifiée respectivement avec TapeStation (Agilent). L’ARN qui en résulte est de qualité suffisante pour le RNA sequencing.

rendement d'ARN extrait du tissu adipeux humain sous-cutané obtenu avec les méthodes Ultraturax T8-IKA (manuelle) et Precellys

Figure 2 :  Rendement d’ARN extrait du tissu adipeux humain sous-cutané obtenu avec les méthodes Ultraturax T8-IKA (manuelle) et Precellys.  Precellys 24 Dual : 6 000 rpm, 2×15 sec, pause de 20 s sur glace, matrice de lyse : CKMix (mélange de billes en céramique de 1,4 mm et 2,8 mm). Tampon : RLT+ß-mercaptoéthanol. 10 échantillons ont été analysés, avec Nanodrop ND-100. Une augmentation de la quantité d’ARN extrait est observée avec Precellys.
Source : INSERM UMRS U872 (Eq7) Service Nutriomique, Nutrition et Endocrinologie, Hôpital de la Pitié-Salpêtrière, Paris, France. (V. Pelloux).

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